El ADN basura de las aves podría ser la clave de una terapia génica segura y eficaz

La reciente aprobación de una terapia con CRISPR Cas9 para tratar la anemia falciforme demuestra que esta herramienta de edición genética puede hacer un gran trabajo en la eliminación de genes, con el objetivo de curar enfermedades raras o hereditarias.

Sin embargo, aún no es posible insertar genes enteros en el genoma humano para sustituir genes defectuosos o deletéreos.

Una nueva técnica que emplea un retrotransposón de aves para insertar genes en el genoma resulta prometedora para la terapia génica, ya que inserta genes en un un "puerto seguro" del genoma humano donde la inserción no alterará genes esenciales ni provocará cáncer.

Los retrotransposones, o retroelementos, son fragmentos de ADN que, cuando se transcriben a ARN, codifican enzimas que copian el ARN de nuevo en ADN en el genoma, un ciclo que abarrota el genoma de ADN retrotransposón. Alrededor del 40% del genoma humano está formado por este nuevo ADN ‘egoísta’ aunque la mayoría de los genes están inutilizados: el llamado ADN basura.

El nuevo método llamado PRINT (Precise RNA-mediated INsertion of Transgenes), aprovecha la capacidad de algunos retrotransposones para insertar eficazmente genes enteros en el genoma sin afectar a otras funciones del mismo.

La técnica complementaría la reconocida capacidad de la tecnología CRISPR Cas para desactivar genes, realizar mutaciones puntuales e insertar segmentos cortos de ADN.

La descripción de PRINT, desarrollada en el laboratorio de Kathleen Collins, profesora de biología molecular y celular de la Universidad de California en Berkeley, se ha publicado esta semana en la revista Nature Biotechnology.

PRINT consiste en la inserción de nuevo ADN en una célula mediante métodos similares a los utilizados para introducir CRISPR Cas9 en las células para editar el genoma. Con este nuevo método, un fragmento de ARN codifica una proteína retroelemento común llamada proteína R2, que tiene varias partes activas, entre ellas una nicasa (una enzima que se une al ADN de doble cadena y lo mella) y una transcriptasa inversa, la enzima que genera la copia de ADN del ARN. El otro ARN es la plantilla para el ADN transgénico que se va a insertar, además de elementos de control de la expresión génica: todo un conjunto transgénico autónomo que la proteína R2 inserta en el genoma, explicaCollins.

Una ventaja clave del uso de la proteína R2 es que inserta el transgén en una zona del genoma que contiene cientos de copias idénticas del mismo gen, cada una de las cuales codifica el ARN ribosómico, la máquina de ARN que traduce el ARN mensajero (ARNm) en proteínas. Con tantas copias redundantes, cuando la inserción interrumpe uno o unos pocos genes de ARN ribosómico, la pérdida de los genes no pasará desapercibida.

Colocar el transgén en un puerto seguro evita un problema importante que se plantea al insertar transgenes a través de un vector de virus humano, que es el método habitual hoy en día: el gen se inserta a menudo al azar en el genoma, desactivando genes que funcionan o alterando su regulación o función, lo que puede provocar cáncer.

"Un método basado en CRISPR-Cas9 puede fijar un nucleótido mutante o insertar un pequeño fragmento de ADN (fijación de secuencias). También se puede eliminar la función de un gen mediante mutagénesis específica", explica Collins. "No estamos eliminando la función de un gen. No estamos corrigiendo una mutación genética endógena".

Enfoque complementario

En este trabajo "adoptamos un enfoque complementario, que consiste en introducir en el genoma un gen expresado de forma autónoma que produce una proteína activa, es decir, volver a añadir un gen funcional como bypass del déficit. Es una suplementación transgénica en lugar de una inversión de la mutación. Para solucionar enfermedades de pérdida de función que surgen de una panoplia de mutaciones individuales del mismo gen, esto es genial", subraya.

Muchas enfermedades hereditarias, como la fibrosis quística y la hemofilia, están causadas por varias mutaciones diferentes en el mismo gen, todas las cuales inhabilitan su función. Cualquier terapia de edición genética basada en CRISPR Cas9 tendría que adaptarse a la mutación específica de cada persona.

En cambio, la suplementación génica mediante PRINT podría suministrar el gen correcto a cada persona con la enfermedad, permitiendo que el organismo de cada paciente produjera la proteína normal, independientemente de la mutación original, indican los autores.

Muchos laboratorios académicos y empresas de nueva creación están investigando el uso de transposones y retrotransposones para insertar genes con fines de terapia génica. Uno de los más estudiados por las biotecnológicas es el LINE-1 (Long INterspersed Element-1), que en los seres humanos se ha duplicado a sí mismo y a algunos genes autoestopistas hasta cubrir aproximadamente el 30 % del genoma, aunque menos de 100 de las copias del retrotransposón LINE-1 de nuestro genoma son funcionales hoy en día, una fracción minúscula del genoma.

Collins, junto con su colegas postdoctorales de la UC Berkeley Akanksha Thawani y Eva Nogales, que también trabaja en el Instituto Médico Howard Hughes, publicaron en diciembre en Nature una estructura de microscopía crioelectrónica de la proteína enzimática codificada por el retroelemento LINE-1.

Ese estudio dejó claro, según Collins, que la proteína del retrotransposón LINE-1 sería difícil de manipular para insertar de forma segura y eficaz un transgén en el genoma humano. Pero investigaciones previas que demostraban que los genes insertados en la región repetitiva del genoma que codifica el ARN ribosómico (el ADNr) se expresan con normalidad sugirieron a Collins que un retroelemento diferente, llamado R2, podría funcionar mejor para la inserción segura de transgenes.

El ADN basura elegido fue el de los pájaros

Dado que R2 no se encuentra en los seres humanos, Collins y el investigador principal Xiaozhu Zhang y la becaria postdoctoral Briana Van Treeck, ambos de la UC Berkeley, examinaron R2 de más de una veintena de genomas animales, desde insectos hasta el cangrejo herradura y otros eucariotas multicelulares, para encontrar una versión que estuviera altamente dirigida a las regiones de ADNr en el genoma humano y fuera eficiente en la inserción de largas longitudes de ADN en la región.

"Después de investigar a docenas de ellos, los verdaderos ganadores fueron los pájaros", dijo Collins, entre ellos el pinzón cebra y el gorrión de garganta blanca.

Aunque los mamíferos no tienen R2 en sus genomas, sí tienen los sitios de unión necesarios para que R2 se inserte eficazmente como un retroelemento, probablemente una señal de que los predecesores de los mamíferos tenían un retroelemento similar a R2 que de alguna manera fue expulsado del genoma de los mamíferos, comentan los investigadores.

En los experimentos, Zhang y Van Treeck sintetizaron ARNm que codificaba la proteína R2 y un ARN molde que generaría un transgén con una proteína fluorescente expresada por un promotor de ARN polimerasa. Se cotransfectaron en células humanas cultivadas. Aproximadamente la mitad de las células se iluminaron en verde o rojo debido a la expresión de la proteína fluorescente bajo luz láser, lo que demostró que el sistema R2 había insertado con éxito una proteína fluorescente funcional en el genoma.

Estudios posteriores demostraron que el transgén se insertaba efectivamente en las regiones de ADNr del genoma y que unas 10 copias de la plantilla de ARN podían insertarse sin alterar la actividad de fabricación de proteínas de los genes de ADNr.

Un gigante de biogénesis de ribosomas

Los investigadores señalan que además de proporcionar un puerto seguro, la inserción de transgenes en las regiones de ADNr del genoma tiene también otras ventajas.

Las regiones de ADNr se encuentran en los brazos gruesos de cinco cromosomas distintos. Todos estos brazos se acurrucan para formar una estructura llamada nucléolo, en la que el ADN se transcribe en ARN ribosómico, que luego se pliega en la maquinaria ribosómica que produce proteínas.

Dentro del nucléolo, la transcripción del ADNr está muy regulada y los genes se reparan rápidamente, ya que cualquier rotura del ADNr, si se dejara propagar, podría paralizar la producción de proteínas. En consecuencia, cualquier transgén insertado en la región del ADNr del genoma se trataría con ‘guantes de seda’ dentro del nucléolo.

"El nucléolo es un gigantesco centro de biogénesis de ribosomas", explica Collins. "Pero también es un entorno realmente privilegiado para la reparación del ADN, con bajo riesgo oncogénico por la inserción de genes. Es brillante que estos exitosos retroelementos –los estoy antropomorfizando– se hayan introducido en el ADN ribosómico. Es multicopia, está conservado y es un lugar seguro en el sentido de que se puede alterar una de estas copias y a la célula no le importa".

Esto hace de la región un lugar ideal para insertar un gen para terapia génica humana, según los investigadores.

Interrogantes

Collins admite que aún se desconoce mucho sobre el funcionamiento de R2 y que quedan interrogantes sobre la biología de la transcripción del ADNr: ¿cuántos genes de ADNr pueden interrumpirse antes de que la célula se altere? Dado que algunas células desactivan muchos de los más de 400 genes de ADNr del genoma humano, ¿son estas células más susceptibles a los efectos secundarios de la PRINT?

Ella y su equipo están investigando estas cuestiones, pero también modificando las diversas proteínas y ARN que intervienen en la inserción de retroelementos para que PRINT funcione mejor en células cultivadas y células primarias de tejidos humanos.

El resultado final, sin embargo, es que "funciona", afirma. "Solo tenemos que entender un poco más la biología de nuestro ADNr para poder aprovecharlo realmente".

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